高速離心技術(shù)在生物學上應(yīng)用

高速離心技術(shù)在生物學上應(yīng)用

前言：離心技術(shù)在生物科學，特別是在生物化學和分子生物學研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應(yīng)用，每個生物化學和分子生物學實驗室都要裝備多種型式的離心機。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。  

制備性超速離心的分離方法：  

1. 差速沉降離心法：  

這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。  

差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。  

此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。

2. 密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）：  

區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。

此法的優(yōu)點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。  

此法的缺點是：①離心時間較長；②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；③操作嚴格，不易掌握。

密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種：  

（1）差速區(qū)帶離心法：當不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20% 的沉降系數(shù)差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。  離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達1.28 kg/cm3和60％。

此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時間  

（2）等密度區(qū)帶離心法：離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。

離心時，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達平衡狀態(tài)后，再延長離心時間和提高轉(zhuǎn)速已無意義，處于等密度點上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達到平衡的時間，離心所需時間以最小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準，有時長達數(shù)日。  

等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關(guān)，但大小和形狀決定著達到平衡的速度、時間和區(qū)帶寬度。等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質(zhì)，但簡單蛋白質(zhì)不適用。

收集區(qū)帶的方法有許多種，例如：  

（1） 用注射器和滴管由離心管上部吸出。

（2） 有針刺穿離心管底部滴出。  

（3） 用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。  

（4）  用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。    

離心操作的注意事項  

高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。  

1. 使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。  

2. 裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉(zhuǎn)頭，及時清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。  

3. 若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。

4. 離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機檢查，及時排除故障。  

5. 每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用

推薦可以使用

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二.超速離心管